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各位辛苦的科研汪们,你们还在用什么方法构建肿瘤模型,你的肿瘤模型是厌氧环境的吗?你的肿瘤模型是梯度厌氧环境吗?你的肿瘤模型能真实反应体内化疗的效果吗?如果不能你不妨看一下下面这篇文章。高手出招,只需三步,高下立判。

近日韩国科学家dong woo cho团队用3d打印技术,仅打印了两个圈一个圆就构建了梯度厌氧模型,并且用该模型培养肿瘤患者的细胞,化疗的效果与患者实际化疗效果一致。与这个模型的神奇效果形成鲜明对比的是,该模型非常简单易做,在自己实验室就可以实现。

就像下面这样:

梯度厌氧肿瘤模型

是不是感觉看上去也太简单了,究竟如何做到梯度厌氧的?

不要着急,按照下面的步骤就可以做出这个简单的模型。

在打印之前先准备一下水凝胶

cho团队用的是猪的头部蛛网膜下腔分离的皮质提取细胞外基质(ecm),取出猪的头部蛛网膜下腔皮质并将它们储存在-80℃。接着将组织切成尺寸为5×5×5mm块状,并在无菌溶液中连续冲洗10次。接下来进行漂洗。

分别用去离子水、含有0.2%十二烷基硫酸钠(duchefa biochemie)的pbs溶液、pbs冲洗15分钟、含有50 u ml-1 dnase的1m nacl溶液、含有0.2%triton x-100的pbs溶液中、含有0.1%过乙酸(sigma-aldrich)和4%乙醇(merck millipore)的溶液等清洗或浸泡,从而除去组织中的细胞。

将脱细胞化的组织碎片冻干,研磨成微小颗粒(<1mm)并在溶解前储存在-20℃。之后用含有胃蛋白酶(1mg>

从图中可以看出制成的ecm是白色的,he染色和dapi染色可以看出细胞核已经被全部去除。

并且水凝胶是温敏的,在体温37℃的时候会固化,硬度会增强。

检测一下bdecm水凝胶培养人胶质母细胞瘤(gbm)细胞效果,用collagen做对照。

cho团队通过细胞增殖、相关因子分泌、形态染色等实验证实bdecm比collagen更加适合培养gbm。

首先测一下细胞增殖,在bdecm中细胞增殖速度比collagen水凝胶中更快。

检测血管生成因子、ecm重塑蛋白等因子也有重大发现。在bdecm中gbm细胞的血管生成因子vegfa和il8分泌量要比生长在collagen中gbm细胞的rna表达量要高很多。并且ecm重塑蛋白ptk2, fn, mmp1, mmp2 and mmp9同样也是生长在bdecm中的gbm细胞表达量比较高。

用这两种胶培养血管内皮细胞,发现生长在bdecm中比生长在collagen中细胞连接分子(pecam1, cdh5 and tjp1)表达量也高很多。

通过将已经生成的gbm细胞球接种到两种水凝胶上培养,并对f-actin染色发现,生长在bdecm中的细胞生长状态会更好,细胞会向外迁移。

对与细胞迁移相关的蛋白cd31染色发现,生长在bdecm中的bgm细胞cd31表达量更高。

接下来用bdecm水凝胶打印过程只需要三步:

cho团队用bdecm水凝胶,一台3d打印机,仅仅三步就构建了梯度厌氧模型。

1)首先用3d打印机打印一个有带两个突出槽的改性硅胶圈,可以透气。

2)之后在内部打印一个圆,所用的材料是接种了人静脉内皮细胞的bdecm水凝胶。

3)最后在中心打印上接种了人胶质母细胞瘤(gbm)细胞的ecm水凝胶

盖上盖子,一个梯度厌氧肿瘤模型构建成功。

先检测一下模型氧气是否梯度减少:

cho 团队先用数学模型计算一下,计算结果显示氧气在模型中呈梯度分布。

再用派诺硝唑(pm)对缺氧的gbm细胞进行染色;用ki67对增殖的gbm细胞进行检测。结果显示缺氧的细胞从中心到四周逐渐减少,细胞的增殖从中心到四周逐渐增多。结果证实,由外往里peripheral,intermediate,core区域内氧含量是逐渐减少的,细胞的增殖也逐渐减少。

下面就是见证奇迹的时刻,建立患者特异性活体gbm模型,并检测一下细胞在模型中对药物的反应和在人体中是一致。

实体瘤异常的新陈代谢环境的重要标志就是缺氧。血管网发展和肿瘤细胞增殖的不均衡,使血管不能为组织细胞提供充足的营养和氧,并将代谢废物运出,这导致了肿瘤内部缺氧区域的形成。为了克服实体肿瘤内部的缺氧微环境,肿瘤细胞会合成促进肿瘤的进展和转移的因子。所以厌氧模型中的细胞比正常培养的细胞在药物处理时的结果会更接近体内。

cho教授团队检测了药物处理时,模型中的细胞和体内处理的情况进行比较。

选取人胶质母细胞瘤患者8人,将患者分为三组:化疗后肿瘤变小组,多发性肿瘤组,和化疗后肿块变大组。

将肿瘤细胞培养在3d打印的模型中,经过药物处理,gamma辐照后,检测细胞活性,最后结果显示,体外模型实验的结果和体内治疗的结果一致。

其他

文章信息

题 目 :a bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy

发表期刊:nature biomedical engineering

发表时间:2019年03月18日

作者介绍

dong-woo cho

韩国浦项科技大学(韩国工科实力最强的大学之一)机械工程部,基于快速原型制作的3d组织/器官打印中心主任。

1986年在威斯康星麦迪逊大学获得机械工程博士学位。

浦项科技大学机械工程系教授。

研究方向:基于3d打印技术的3d微加工,其在组织工程中的应用,以及更广泛地应用于生物相关的制造。最近专注于组织/器官打印技术和高性能生物墨水的开发。

曾在几家国际期刊的编辑委员会任职。

在制造和组织工程领域的各种国际期刊上发表了200多篇学术论文,并参与撰写10本与组织工程相关的书籍。

后记

这个模型非常简单,打印过程只需要几分钟,却可以省去大量无效的体外实验。只要有一台可以控温的桌面级打印机就可以完成。上普桌面式打印机共能齐全,不仅仅喷头可以调节温度,打印平台也可以控温;体积小巧,可以放到超净工作台;价格低,普通实验室都可以购买。

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